久久免费成人黄片|一区二区婷婷在线视频|亚洲女V在线免费观看|免费福利视频一区二区三区|最新一区二区不卡视频在线|精品久久久久中文字幕一区|国产成人A在线观看视频免费|国产免费无码秘 一区二区三区

一、實(shí)驗(yàn)原理：

免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation, Co-IP）以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)，用于研究兩個蛋白質(zhì)在活體細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的經(jīng)典的方法。當(dāng)活體細(xì)胞在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保留下來。如果用蛋白質(zhì) X 的抗體免疫沉淀 X，與 X 在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì) Y 可以與蛋白質(zhì) X 一起以復(fù)合物的形式被沉淀下來，西北Co-IP實(shí)驗(yàn)外包_西寧Co-IP實(shí)驗(yàn)_西安淳風(fēng)生物科技有限公司，然后經(jīng)Westernblot 或質(zhì)譜的方法對蛋白質(zhì) Y 進(jìn)行檢測或鑒定。

 

沈陽全基因合成公司_用的舒心醫(yī)藥、保養(yǎng)-西安淳風(fēng)生物科技有限公司

二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?

確定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在活體細(xì)胞體內(nèi)相互作用，也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的相互作用搭檔。

 

三、操作步驟：
1. 適用范圍依據(jù)抗體類型（蛋白質(zhì) X 自身特異性抗體、蛋白質(zhì) X 融合商品化標(biāo)簽抗體）。本方法試?yán)e：蛋白質(zhì) X 融合 FLAG 標(biāo)簽，將該載體轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)入水稻獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因植株，然后用 FLAG 標(biāo)簽抗體利用 Co-IP 方法沉淀與蛋白質(zhì) X 互作的蛋白質(zhì)復(fù)合物，用 Westernblot 方法檢測蛋白質(zhì) Y 是否一起被沉淀下來，以確定在水稻體內(nèi)蛋白質(zhì) X 和蛋白質(zhì) Y 是否真正相互作用。
2. 取水稻葉片 5 g，經(jīng)液氮研磨后，加入 3 倍體積蛋白 IP 緩沖液，在 4°C 混勻 30 min。
3. 于 4°C， 12,000 g 離心 30 min，將上清轉(zhuǎn)移至一個預(yù)冷的新的離心管中。
4. 用 0.22 μm 濾膜過濾上清，取過濾的 50 μl 上清作為 Input，用于蛋白質(zhì) X 的檢測。
5. Anti-FLAG M2 Affinity Gel預(yù)處理。取出50 μl預(yù)混勻的Anti-FLAG M2 Affinity Gel 轉(zhuǎn)移至一預(yù)冷的離心管中。于 4°C， 4,000 rpm 離心 1 min，小心將上清吸取棄之。加入 20 倍體積預(yù)冷的 TBS 緩沖液以平衡 Gel，西北Co-IP實(shí)驗(yàn)外包_貴陽Co-IP公司_西安淳風(fēng)生物科技有限公司，于 4°C， 4,000 rpm 離心 1 min，小心將上清吸取棄之；重復(fù) 3 次。于 4°C， 12,000 rpm 離心 15 s，小心將上清吸取棄之。
6. 取蛋白質(zhì)加入到已平衡化的 Anti-FLAG M2 Affinity Gel 中，于 4°C孵育。

7. 洗脫 Gel。于 4°C， 4,000 rpm 離心 1 min，小心將上清吸取棄之。加入 1,500μl 預(yù)冷的 IP 緩沖液洗脫 Gel，于 4°C 孵育 5 min， 4,000 rpm 離心 1 min，小心將上清吸取棄之；如此重復(fù) 3 次。于 4°C， 12,000 rpm 離心 15 s，小心將上清吸取棄之。

8. 加入約 40 μl 2 倍上樣緩沖液， 100°C 變性 5 min，稍離心，取適量體積進(jìn)行Westernblot 實(shí)驗(yàn)，分別用商品化 FLAG 標(biāo)簽抗體和蛋白質(zhì) Y 抗體進(jìn)行檢測。

以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。 其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。目前多用精制的prorein A預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的prorein A就能吸附抗原達(dá)到精制的目的。這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。一、試劑準(zhǔn)備 1. 預(yù)冷PBS，RIPA Buffer，細(xì)胞刮子（用保鮮膜包好后，埋冰下），離心機(jī)。 2. 用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，一次吸干PBS。 3. 加入預(yù)冷的RIPA Buffer(1 ml/107個細(xì)胞、10 cm培養(yǎng)皿或150 cm2培養(yǎng)瓶，0.5 ml/5x106個細(xì)胞、6 cm培養(yǎng)皿、75 cm2培養(yǎng)瓶）。 4. 用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下，把懸液轉(zhuǎn)到1.5EP管中，4℃，緩慢晃動15 min（EP管插冰上，置水平搖床上）。 5. 4℃，14000 g離心15 min，立即將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中。 6. 準(zhǔn)備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠。 7. 每1 ml總蛋白中加入100 ul Protein A瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃10 min（EP管插冰上，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白，降低背景。 8. 4℃，14000 g離心1 5min，將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，去除Protein A珠子。 9． （Bradford 法）做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定蛋白濃度，測前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細(xì)胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝后，可以在-20℃保存一個月）。 10. 用PBS將總蛋白稀釋到約1 ug/ul，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白在細(xì)胞中含量較低，則總蛋白濃度應(yīng)該稍高（如10 ug/ul）。 11. 加入一定體積的兔抗到500 ul總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細(xì)胞系中的多少而異。 12. 4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫2h，激酶活性分析建議用2 h室溫孵育。 13. 加入100 ul Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復(fù)合物，4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫1 h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 ul "過渡抗體"（兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG）。 14. 14000 rpm瞬時離心5 s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，去上清，用預(yù)冷的RIPA buffer洗3遍，800 ul/遍，RIPA buffer有時候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物內(nèi)部的結(jié)合，可以使用PBS。 15. 用60 ul 2x上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定（60 ul足夠上三道）。 16. 將上樣樣品煮5 min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時凍-20℃，留待以后電泳，電泳前應(yīng)再次煮5 min變性。 二、免疫共沉淀反應(yīng) 1． 轉(zhuǎn)染后24-48 h 可收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30 min, 細(xì)胞裂解液于4°C，離心30 min后取上清； 2． 取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液加1ug相應(yīng)的抗體加入到細(xì)胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過夜； 3． 取10 ul protein A 瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3 次，每次3 000 rpm離心3 min； 4.． 將預(yù)處理過的10 ul protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細(xì)胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4 h，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連； 5． 免疫沉淀反應(yīng)后，在4°C 以 3000 rpm 速度離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1 ml裂解緩沖液洗3－4次；加入15 ul的2xSDS 上樣緩沖液，沸水煮5分鐘； 6． SDS-PAGE，Western blotting或質(zhì)譜儀分析。 三、通過免疫共沉淀確定結(jié)合蛋白 1．用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養(yǎng)板上的適宜細(xì)胞。刮去每塊板上的細(xì)胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中； 2．將每毫升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到微量離心管中，在微量離心機(jī)上4℃離心15 ； 3．收集上清（約30 ml）并加入30 ug的適當(dāng)抗體，4℃搖動免疫沉淀物1 h； 4．加入0.9 ml的蛋白質(zhì)A-Sepharose 懸液，4℃搖動免疫沉淀物30 min； 5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重復(fù)洗5次。用NETN洗一次； 6．吸出混合物的液體部分。加入800 ul的1xSDS膠加樣緩沖液到球珠中，煮沸4 min； 7．將樣品加入到大孔的不連續(xù)SDS-PAGE梯度膠中，在10 mA的恒定電流下電泳過夜； 8．通過考馬斯亮藍(lán)染色觀察蛋白質(zhì)泳帶； 9．從膠上切下目標(biāo)帶，將其放到微量離心管中，用1 ml 50%乙腈洗兩次，每次3 min； 10． 用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質(zhì)，再將肽電洗脫； 11． 通過窄孔高效液相色譜分離肽。將收集的肽在ABI 477A或494A機(jī)器上進(jìn)行自動Edman降解測序。 注意事項(xiàng)： 1. 細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)——蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40 或Triton X-100）。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗(yàn)確定。不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS），細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，西北Co-IP實(shí)驗(yàn)外包_上海Co-IP技術(shù)服務(wù)_西安淳風(fēng)生物科技有限公司，如商品化的。 2. 使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用。 3. 使用對照抗體： 單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單抗 兔多克隆抗體：正常兔IgG 4. 確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生。 5. 要確?？贵w的特異性，即在不表達(dá)抗原的細(xì)胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀。 6. 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來確定。

相關(guān)資訊查看