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背景說明

 

    DNA pull down以感興趣的DNA序列為中心，尋找與該序列結合的蛋白質(zhì)，比較常見的應用是尋找某特定基因啟動子的轉(zhuǎn)錄因子。

 

啟動子通常位于結構基因5"端上游，含有RNA聚合酶特異性結合和轉(zhuǎn)錄起始所需的保守序列。轉(zhuǎn)錄因子也稱反式作用因子，是一種DNA結合蛋白，它能與真核基因的順式作用元件（如啟動子、增強子等）特異性結合來激活或抑制基因表達。轉(zhuǎn)錄因子有4個主要結構域：DNA結合域決定轉(zhuǎn)錄因子的特異性，轉(zhuǎn)錄調(diào)控域（包括激活域或抑制域）決定轉(zhuǎn)錄因子的功能，寡聚化位點使不同轉(zhuǎn)錄因子間發(fā)生相互作用，核定位信號控制轉(zhuǎn)錄因子進入細胞核。

 

一個基因的啟動子通常會結合多種轉(zhuǎn)錄因子，尋找啟動子的特異轉(zhuǎn)錄因子，有助于我們理解這些啟動子下游的功能基因是如何被調(diào)控的。

 

▼應用場景

    

         DNA pull down用于研究DNA結合蛋白和特定的DNA序列的相互作用。

 

▼實驗原理

 

   DNA pull down是一種研究DNA與蛋白互作的方法。其原理是：生物素標記的DNA片段結合在鏈霉親和素磁珠上，再與核蛋白孵育，從而捕獲并純化出與DNA片段互作的蛋白。捕獲的蛋白一方面可以通過Western blot驗證某一特定蛋白是否與靶DNA片段結合；另一方面也可以進行質(zhì)譜鑒定，篩選出與DNA片段可能互作的蛋白質(zhì)。

 

▼我們的優(yōu)勢

 

1.      

表達蛋白時有自研改造的適合不同蛋白表達的標簽載體，確保表達出可溶性蛋白；

2.      

 

原核表達對培養(yǎng)基、溫度、ph、時間、分子伴侶等進行優(yōu)化組合，確保可溶性蛋白產(chǎn)量；

3.      

 

添加各種裂解液和蛋白酶抑制劑的超聲破碎緩沖液，確保蛋白產(chǎn)量；

4.      

 

自研的超濾緩沖液配方，保護蛋白且不影響蛋白和DNA結合；

5.      

Thermo原裝試劑標記探針，保證標記效率；

6.      

自研的洗雜液配方，確保非特異結合蛋白的流出

7.      

自研的洗脫液配方，確保生物素探針的完全洗脫

8.      

 自研封閉液和洗滌液，降低實驗背景。

Pull down技術的基本原理是將一種蛋白質(zhì)固定于某種基質(zhì)上（如Sepharose），但細胞抽提液經(jīng)過該基質(zhì)時，可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒有被吸附的“雜質(zhì)”則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過改變洗脫液或洗脫條件而回收下來。通過pull down技術可以確定已知的蛋白與釣出蛋白或已純化的相關蛋白間的相互作用關系，從體外轉(zhuǎn)錄或翻譯體系中檢測出蛋白相互作用關系。 DNA pull down實驗是用于研究蛋白質(zhì)和DNA之間相互作用的常用技術。下面是DNA pull down實驗的一般流程： DNA探針的制備：首先設計和合成包含目標DNA序列的探針?？梢允褂没瘜W合成或PCR方法從基因組DNA或質(zhì)粒中擴增出需要的DNA片段。 DNA探針標記：將DNA探針標記上特定的分子或熒光染料，常用的標記方法包括生物素化、熒光標記等。這樣做的目的是便于后續(xù)步驟中檢測和純化與DNA結合的蛋白質(zhì)。 細胞提取：收集感興趣的細胞系或組織，使用細胞裂解緩沖液將細胞打斷并釋放出細胞內(nèi)成分。 蛋白質(zhì)-DNA結合反應：將標記的DNA探針加入細胞提取物中，使其與細胞提取中的蛋白質(zhì)發(fā)生特異性結合。 DNA pull down：將混合物通過親和純化柱（如瓊脂糖親和柱）或磁珠（如磁珠上的生物素）進行過濾或沉淀。在此過程中，與DNA結合的蛋白質(zhì)將被捕獲并保留下來，而未結合的蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)則被洗脫。 洗脫和分析：通過洗脫步驟將蛋白質(zhì)從親和介質(zhì)上解離開來?？梢允褂貌煌姆椒ㄏ疵?，如改變pH值、加入競爭性結合物等。而后，洗脫后的蛋白質(zhì)可以通過Western blotting、質(zhì)譜分析等技術進行進一步的鑒定和分析。 具體的實驗條件和步驟可能因?qū)嶒災康暮蜆悠奉愋投兴煌?，并且實驗中的各操作均需遵循相關實驗室安全操作規(guī)程。 1．探針設計及標記 ① 采用基因組DNA做模板，經(jīng)PCR擴增啟動子片段； ② 將其克隆至pMD-18T克隆載體，并測序鑒定成功； ③ 使用PCR法或末端標記法標記探針； ④ 標記的探針利用凝膠回收試劑盒純化回收探針，并檢測探針濃度； ⑤ -20℃保存，待用； 2．Pull down ① 預先混合 5 μg 生物素標記的 DNA 和 500 μg 核蛋白，置于冰上； ② 取 100μL 串珠，用冰冷 PBS 洗一次，5000 g 離心 30 秒； ③ 將 DNA 與蛋白的混合物加到串珠中，重懸珠子； ④ 4℃孵育 1 小時； ⑤ 5000g，離心 30 秒，去除上清，收集沉淀； ⑥ 用冰冷 PBS 洗串珠三次，5000 g 離心 1 分鐘，盡可能去除上清，收集沉淀； ⑦  加入 30 μL 蛋白上樣緩沖液，重懸沉淀，沸水煮 10 分鐘， 3．蛋白質(zhì)檢測-- Western Blot ① 電泳：實驗采用不連續(xù)系統(tǒng)蛋白質(zhì)SDS-PAGE，濃度為5%濃縮膠和8~12%濃度分離膠；每孔上樣40~60 ug總蛋白，開始電壓為100 v,到達分離膠后調(diào)為120 v； ② 轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜為恒流轉(zhuǎn)膜，電流為200 mA，時間根據(jù)目的蛋白分子量選擇60~120 min。 ③ 封閉：蛋白膜放置到TBST溶液中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液；加入5%脫脂奶粉封閉液，室溫50rpm，封閉60分鐘。 ④ 孵育一抗：根據(jù)蛋白Marker指示將PVDF膜剪開，參考一抗?jié)舛?；將PVDF膜分別放入含各自一抗溶液中，4度孵育一抗過夜，然后放入TBST洗滌液，搖動洗滌3次，每次15 min。 ⑤ 孵育二抗：參考二抗?jié)舛龋幢壤♂尷备^氧化物酶(HRP)標記的二抗。將PVDF膜加入稀釋好的二抗，室溫搖動孵育1h；放入TBST洗滌液，搖動洗滌3次，每次15 min。 ⑥ 顯色：使用化學發(fā)光試劑，黑暗處顯色，用X光片壓片，顯影液及定影液洗片。 4．蛋白質(zhì)檢測-- MS ① 切膠：用刀片切取膠粒（膠粒直徑1-2 mm），置于1.5mL EP管中。 ② 清洗：用200 uL MilliQ震蕩清洗2次，每次10分鐘。 ③ 脫色：對于考染膠，福州DNA pull down實驗外包_蘭州DNA pull down實驗_西安淳風生物科技有限公司，福州DNA pull down實驗外包_長春DNA pull down實驗_西安淳風生物科技有限公司，加考染膠色液（25mM NH4HCO3，福州DNA pull down實驗外包_鄭州DNA pull down技術服務_西安淳風生物科技有限公司， 50% ACN）200uL，37℃ 20分鐘或超聲脫色5分鐘，吸干，重復脫色2-3次，至藍色褪去。 ④ 脫水：加ACN 100 μL脫水至膠粒變白，吸棄ACN。 ⑤ 清洗：用200 μL MilliQ震蕩清洗2次，每次10分鐘；然后用200uL 50% ACN震蕩清洗2次，每次10分鐘。 ⑥ 脫水：加ACN 100 μL 脫水至膠粒變白，吸棄ACN。 ⑦ 用25 mM NH4HCO3稀釋Trypsin 至12.5 mg/ml，每管加10 μL，稍微離心一下，讓酶液與膠粒充分接觸，4℃放置30 min ，待酶液被膠粒完全吸收，吸棄多余的酶液，加25 mM NH4HCO3 20uL，37℃過夜(16h)。 ⑧ 質(zhì)譜樣品使用德國Bruker公司的Ultraflex III質(zhì)譜儀開展分析，參數(shù)設置：反射模式； ⑨ 離子源加速電壓1為24kv； ⑩ 加速電壓2為22kv； 11 離子延遲提取0.000ns； 12 真空度1.4×10-7 Torr； 13 質(zhì)譜信號單次掃描累加200次； 14 使用標準Maker峰作為外標校正質(zhì)譜峰，正離子譜測定，測定范圍控制在700-4000； 15 樣品的肽質(zhì)量指紋圖譜，胰酶自降解峰和污染物質(zhì)的峰自動剔除； 16 利用LIFT軟件將PMF強度較大的5個峰進行串級質(zhì)譜分析（峰強度大于300）。

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