久久免费成人黄片|一区二区婷婷在线视频|亚洲女V在线免费观看|免费福利视频一区二区三区|最新一区二区不卡视频在线|精品久久久久中文字幕一区|国产成人A在线观看视频免费|国产免费无码秘 一区二区三区

GST-Pull down是在體外驗(yàn)證兩種蛋白質(zhì)結(jié)合的方法之一，合肥GST-pull down實(shí)驗(yàn)外包_呼和浩特GST-pull down實(shí)驗(yàn)_西安淳風(fēng)生物科技有限公司，其原理是目的蛋白與GST融合表達(dá)，蛋白固定在谷胱甘肽（GSH）親和樹脂上，作為與目的蛋白親和的支持物，起到“誘餌蛋白”的作用。目標(biāo)蛋白溶液通過(guò)柱子，從中可以捕獲相互作用的“捕獲蛋白”（目標(biāo)蛋白）。結(jié)合物洗脫后，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡(WB)分析證實(shí)了兩種蛋白質(zhì)之間的相互作用?！罢T餌蛋白”和“捕獲蛋白”都可以通過(guò)細(xì)胞裂解物、純化蛋白、表達(dá)系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)獲得，這種方法簡(jiǎn)單易操作。實(shí)驗(yàn)操作流程如下：

1. 誘導(dǎo)與轉(zhuǎn)化：

將制備好的分別帶GST和His標(biāo)簽的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞中

A.質(zhì)粒加入細(xì)菌

B.冰上30min

C. 42℃水浴5s或1min

D.向轉(zhuǎn)化混合物中加入500μL LB，不加抗生素，160 rpm 37 ℃搖床振蕩1h

E.涂板隔夜培養(yǎng)；pGEX用A板，pET用K板

F.挑選陽(yáng)性克?。ㄒ锔鶕?jù)自己做的質(zhì)粒選擇）

G.將陽(yáng)性克隆加入至3 mL LB培養(yǎng)液，220 rpm 37 ℃過(guò)夜小搖

H.取200 μL菌液加入20 mL LB培養(yǎng)液（50 mL離心管內(nèi)），1:1000分別加入氨芐西林（pGEX）及卡那霉素（pET-28a）220 rpm 37 ℃ 4-6小時(shí)

I.菌液呈渾濁狀后檢測(cè)OD值，OD值0.6時(shí)加入0.5 mM的IPTG，繼續(xù)搖菌4小時(shí)

J. 5000 rpm離心10min后收集菌體，去除上清

西寧染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)服務(wù)_鄭州醫(yī)藥、保養(yǎng)技術(shù)服務(wù)-西安淳風(fēng)生物科技有限公司

2. 裂解細(xì)菌：

A.向菌體中加入1 mL含1x蛋白酶抑制劑的BC100緩沖液（不含Triton X-100）重新懸浮細(xì)菌。

B.將步驟A中的菌體懸液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，置于冰上。超聲裂解細(xì)菌，超聲30秒，冰上靜置30秒，共反復(fù)5次。

C.超聲后加入110 μL 10% Triton X-100, 4 ℃震蕩1h。

D. 4 ℃，12000 rpm離心30分鐘。收集上清液。

E.取20 μL上清，加入loading buffer，煮蛋白后SDS凝膠電泳，以考馬斯亮蘭染色檢測(cè)蛋白表達(dá)。留40 μL裂解液作為input。

3. GST融合蛋白的純化：

A.清洗beads:用含0.1% Triton X-100的BC100緩沖液洗20 μL GST-sepharose beads，5000 rpm離心30秒2次，共清洗3次。

B.重懸beads:以BC100緩沖液1：1重懸GST-sepharose beads。

C.孵育蛋白：將GST融合蛋白裂解液加入洗滌后的GST-sepharose beads中。4 ℃震蕩孵育1小時(shí)。

D.收集beads: 5000 rpm離心30秒，兩次，沉淀beads。

E.清洗beads:吸出上清，合肥GST-pull down實(shí)驗(yàn)外包_長(zhǎng)沙GST-pull down公司_西安淳風(fēng)生物科技有限公司，用1 mL BC500緩沖液（含1% Triton X-100，不含蛋白酶抑制劑）清洗beads 3次。5000 rpm離心30秒，兩次，沉淀beads。

F.清洗beads:以1 mL BC100緩沖液（含0.1% Triton X-100，不含蛋白酶抑制劑）清洗beads 3次。5000 rpm離心30秒，兩次，沉淀beads

G.以300 μL BC100緩沖液重懸beads（含0.1% Triton X-100）。

4. His融合蛋白的純化：

采用His-tagged protein purification Magbeads（Absin,中國(guó)）進(jìn)行His融合蛋白的純化，按照制造商的使用說(shuō)明進(jìn)行操作。

A.取0.3 mL的磁珠，磁性分離，washing buffer清洗3次。

B.細(xì)菌裂解液加入磁珠中，4 ℃震蕩孵育1小時(shí)，washing buffer清洗3次，每次清洗后均磁性分離磁珠。

C.在磁珠中加入400 μL Elution buffer，室溫震蕩2分鐘，磁性分離收集洗液。反復(fù)3次。

D.將3次中收集到的液體用10K的超濾管進(jìn)行濃縮，5000 g，離心15分鐘，合肥GST-pull down實(shí)驗(yàn)外包_鄭州GST-pull down公司_西安淳風(fēng)生物科技有限公司，加入500 μL BC100緩沖液進(jìn)行緩沖液置換，5000g，離心15分鐘，收集到50-100 μL濃縮蛋白。

5. 蛋白結(jié)合及檢測(cè)：

A.純化蛋白結(jié)合：向GST及GST-DNMT3L beads中分別加入10 μL His-USP46純化蛋白，4 ℃震蕩孵育1小時(shí)，5000 rpm離心30秒，兩次，沉淀beads。

B.吸出上清。以1 mL BC100緩沖液（含0.1% Triton X-100）清洗beads 3次。

C.加入1 x loading buffer 50 μL，連同input樣本，95 ℃金屬浴5 min。離心分離beads，取上清進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

▼背景說(shuō)明 蛋白互作在細(xì)胞生命活動(dòng)中起著關(guān)鍵作用, 在不同時(shí)空層面上參與多種細(xì)胞過(guò)程, 因此研究蛋白互作對(duì)于理解分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)至關(guān)重要。通常情況下, 利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選植物蛋白互作必須利用體外和體內(nèi)系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證。Pull-down就是驗(yàn)證植物蛋白互作的常用技術(shù)，被廣泛用于體外驗(yàn)證蛋白間的直接互作。 ▼應(yīng)用場(chǎng)景 Pull-down 技術(shù), 也叫蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn), 是一種行之有效的驗(yàn)證酵母雙雜交系統(tǒng)的體外試驗(yàn)技術(shù)。 ▼實(shí)驗(yàn)原理 將靶蛋白-GST 融合蛋白親和固化在谷胱甘肽標(biāo)記的珠子上, 作為與目的蛋白親和的支撐物, 充當(dāng)“誘餌蛋白”, 目的蛋白溶液與之孵育, 可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白), 洗脫結(jié)合物后通過(guò) SDS-PAGE 電泳分析, 從而證實(shí)兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白, 誘餌蛋白和“捕獲蛋白”均可通過(guò)細(xì)胞裂解物、純化的蛋白、表達(dá)系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。在Pull-down 實(shí)驗(yàn)中, 設(shè)計(jì)恰當(dāng)?shù)膶?duì)照實(shí)驗(yàn)非常重要, 該對(duì)照可以是表達(dá)有GST (非誘餌融合蛋白)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞裂解物, 也可以是將 GST 加到非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的裂解物中。 GST 融合蛋白 Pull-down 的方法可以用來(lái)鑒定能與已知融合蛋白相互作用的未知蛋白質(zhì), 也可以鑒定2個(gè)已知蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。此方法簡(jiǎn)單易行, 操作方便。但Pull-down 的結(jié)果并不能真實(shí)的反應(yīng)蛋白質(zhì)之間的相互作用, 因?yàn)樵诨铙w內(nèi)它們不一定在亞細(xì)胞空間上能碰到, 所以并不意味著在生理?xiàng)l件下一定結(jié)合。 （1） 將表達(dá)GST融合蛋白（實(shí)驗(yàn)組）和GST（對(duì)照組）的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入BL21菌株中。 （2） 分別挑取陽(yáng)性單克隆于3ml含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37度，200轉(zhuǎn)，過(guò)夜培養(yǎng)。 （3） 將過(guò)夜培養(yǎng)的3ml菌液接入300ml（1:100）含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37度，200轉(zhuǎn)，2.5-3h，搖至OD600=0.8左右。 （4） 取出0.5ml菌液于4度保存作為誘導(dǎo)前菌液。 （5） 同時(shí)在剩余菌液中加入終濃度為1mM/L的IPTG，16-27度，100-200轉(zhuǎn)，誘導(dǎo)8-16h。 （6） 誘導(dǎo)后取出0.5 mL 菌液于4°C 保存作為誘導(dǎo)后菌液; （7） 4°C, 6 000 rpm, 離心15 分鐘, 收集誘導(dǎo)后菌體, 用20 mL PBS 溶液重懸菌體后, 轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中; （8） 4°C, 6 000 rpm, 10 分鐘, 倒掉上清, 液氮速凍, –80°C 保存用于純化; （9） 4°C, 10 000 rpm, 2 分鐘, 收集誘導(dǎo)前菌液和誘導(dǎo)后菌液, 用80 μL1XSDS 上樣緩沖液重懸菌體; （10） 100°C, 煮沸樣品5 分鐘, 12 000 rpm, 離心2 分鐘, 取上清對(duì)誘導(dǎo)結(jié)果進(jìn)行SDS-PAGE 檢測(cè)。 50% GST Sepharose 4B slurry的準(zhǔn)備 （11） 將原75% Glutathione Sepharose 4B slurry 彈至均勻; （12） 取677 μL 原液/管, 3 000 rpm, 離心5 分鐘, 棄上清; （13） 加500 μLPBS, 顛倒混勻, 3 000 rpm, 離心5 分鐘, 棄上清, 反復(fù)5 次; （14） 加500 μLPBS, 顛倒混勻, 配成50% Glutathione Sepharose 4B 備用。 100mM IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22μm濾膜抽濾，-20℃保存。 5.1.3 GST融合蛋白的純化 （15） 從–80°C 冰箱中拿出凍存的樣品, 冰浴溶解菌體后, 加入4 mL PBS 和40 μL PMSF(100 mmol.L–1)和40 μL 蛋白酶抑制劑Cocktail (100X)進(jìn)行充分重懸;（還有這種做法：每升菌液約以50 mL PBS重懸，加入1%Triton X-100（v/v），1％β-巰基乙醇（v/v），PMSF（終濃度1 mM）） 細(xì)胞裂解需要采用溫和的裂解條件（問下天地人和細(xì)胞裂解液配方GST的）。為了不破壞細(xì)胞內(nèi)存在的蛋白與蛋白之間的相互作用, 多采用非離子變性劑(NP-40 或Triton X-100), 不能采用高濃度的變性劑(0.2% SDS),細(xì)胞裂解液中要添加各種酶的抑制劑。 （16） 超聲破碎, 頻率: 100~200 瓦; 超聲40 秒, 停止20 秒, 共5 次(菌體由渾濁變?yōu)槌吻?; （17） 4°C, 15 000 rpm 離心40 分鐘; （18） 冰上轉(zhuǎn)移細(xì)胞裂解液上清至潔凈的10 mL 離心管中; （19） 在細(xì)胞裂解液上清中加入50 μL 50% Glutathione Sepharose 4B, 4°C, 靜音混合器上溫和旋轉(zhuǎn)孵育30–60 分鐘; （20） 3 000 rpm 離心5 分鐘, 棄上清, 此時(shí)Sepharose 上即結(jié)合了GST融合蛋白或GST; （21） 在管中加入預(yù)冷的500 μL PBS (沿壁加入, 動(dòng)作輕柔, 以免打斷珠子與蛋白的聯(lián)接), 輕晃懸浮珠子, 將Sepharose 洗滌1 次, 3 000 rpm 離心3 分鐘, 棄上清; （22） 反復(fù)用PBS 洗滌3 次(最后用小槍吸凈珠子表面水膜), 即獲得結(jié)合有GST 融合蛋白或GST 的Sepharose, 用大口徑的移液槍頭轉(zhuǎn)移至1.5 mL 尖底離心管中; （23） 如果用于檢測(cè), 在Sepharose 加入15–20 μL1xSDS 蛋白上樣緩沖液, 在沸水中煮3分鐘, 12 000 rpm 離心1 分鐘, 取上清作SDS-PAGE 電泳; （24） 如果用于Pull-down 檢測(cè), 繼續(xù)后續(xù)操作。

相關(guān)資訊查看