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背景說(shuō)明

 

    DNA pull down以感興趣的DNA序列為中心，蘭州DNA pull down公司_武漢DNA pull down技術(shù)服務(wù)_西安淳風(fēng)生物科技有限公司，尋找與該序列結(jié)合的蛋白質(zhì)，比較常見(jiàn)的應(yīng)用是尋找某特定基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子。

 

啟動(dòng)子通常位于結(jié)構(gòu)基因5"端上游，含有RNA聚合酶特異性結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始所需的保守序列。轉(zhuǎn)錄因子也稱反式作用因子，是一種DNA結(jié)合蛋白，它能與真核基因的順式作用元件（如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等）特異性結(jié)合來(lái)激活或抑制基因表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子有4個(gè)主要結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合域決定轉(zhuǎn)錄因子的特異性，轉(zhuǎn)錄調(diào)控域（包括激活域或抑制域）決定轉(zhuǎn)錄因子的功能，寡聚化位點(diǎn)使不同轉(zhuǎn)錄因子間發(fā)生相互作用，核定位信號(hào)控制轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核。

 

一個(gè)基因的啟動(dòng)子通常會(huì)結(jié)合多種轉(zhuǎn)錄因子，尋找啟動(dòng)子的特異轉(zhuǎn)錄因子，有助于我們理解這些啟動(dòng)子下游的功能基因是如何被調(diào)控的。

 

▼應(yīng)用場(chǎng)景

    

         DNA pull down用于研究DNA結(jié)合蛋白和特定的DNA序列的相互作用。

 

▼實(shí)驗(yàn)原理

 

   DNA pull down是一種研究DNA與蛋白互作的方法。其原理是：生物素標(biāo)記的DNA片段結(jié)合在鏈霉親和素磁珠上，再與核蛋白孵育，從而捕獲并純化出與DNA片段互作的蛋白。捕獲的蛋白一方面可以通過(guò)Western blot驗(yàn)證某一特定蛋白是否與靶DNA片段結(jié)合；另一方面也可以進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，篩選出與DNA片段可能互作的蛋白質(zhì)。

 

▼我們的優(yōu)勢(shì)

 

1.      

表達(dá)蛋白時(shí)有自研改造的適合不同蛋白表達(dá)的標(biāo)簽載體，確保表達(dá)出可溶性蛋白；

2.      

 

原核表達(dá)對(duì)培養(yǎng)基、溫度、ph、時(shí)間、分子伴侶等進(jìn)行優(yōu)化組合，確保可溶性蛋白產(chǎn)量；

3.      

 

添加各種裂解液和蛋白酶抑制劑的超聲破碎緩沖液，確保蛋白產(chǎn)量；

4.      

 

自研的超濾緩沖液配方，保護(hù)蛋白且不影響蛋白和DNA結(jié)合；

5.      

Thermo原裝試劑標(biāo)記探針，保證標(biāo)記效率；

6.      

自研的洗雜液配方，確保非特異結(jié)合蛋白的流出

7.      

自研的洗脫液配方，確保生物素探針的完全洗脫

8.      

 自研封閉液和洗滌液，降低實(shí)驗(yàn)背景。

Pull down技術(shù)的基本原理是將一種蛋白質(zhì)固定于某種基質(zhì)上（如Sepharose），但細(xì)胞抽提液經(jīng)過(guò)該基質(zhì)時(shí)，可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒(méi)有被吸附的“雜質(zhì)”則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過(guò)改變洗脫液或洗脫條件而回收下來(lái)。通過(guò)pull down技術(shù)可以確定已知的蛋白與釣出蛋白或已純化的相關(guān)蛋白間的相互作用關(guān)系，從體外轉(zhuǎn)錄或翻譯體系中檢測(cè)出蛋白相互作用關(guān)系。 DNA pull down實(shí)驗(yàn)是用于研究蛋白質(zhì)和DNA之間相互作用的常用技術(shù)。下面是DNA pull down實(shí)驗(yàn)的一般流程： DNA探針的制備：首先設(shè)計(jì)和合成包含目標(biāo)DNA序列的探針?？梢允褂没瘜W(xué)合成或PCR方法從基因組DNA或質(zhì)粒中擴(kuò)增出需要的DNA片段。 DNA探針標(biāo)記：將DNA探針標(biāo)記上特定的分子或熒光染料，常用的標(biāo)記方法包括生物素化、熒光標(biāo)記等。這樣做的目的是便于后續(xù)步驟中檢測(cè)和純化與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。 細(xì)胞提取：收集感興趣的細(xì)胞系或組織，使用細(xì)胞裂解緩沖液將細(xì)胞打斷并釋放出細(xì)胞內(nèi)成分。 蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合反應(yīng)：將標(biāo)記的DNA探針加入細(xì)胞提取物中，使其與細(xì)胞提取中的蛋白質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合。 DNA pull down：將混合物通過(guò)親和純化柱（如瓊脂糖親和柱）或磁珠（如磁珠上的生物素）進(jìn)行過(guò)濾或沉淀。在此過(guò)程中，與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)將被捕獲并保留下來(lái)，而未結(jié)合的蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)則被洗脫。 洗脫和分析：通過(guò)洗脫步驟將蛋白質(zhì)從親和介質(zhì)上解離開(kāi)來(lái)?？梢允褂貌煌姆椒ㄏ疵?，如改變pH值、加入競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合物等。而后，洗脫后的蛋白質(zhì)可以通過(guò)Western blotting、質(zhì)譜分析等技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定和分析。 具體的實(shí)驗(yàn)條件和步驟可能因?qū)嶒?yàn)?zāi)康暮蜆悠奉愋投兴煌⑶覍?shí)驗(yàn)中的各操作均需遵循相關(guān)實(shí)驗(yàn)室安全操作規(guī)程。 1．探針設(shè)計(jì)及標(biāo)記 ① 采用基因組DNA做模板，蘭州DNA pull down公司_西北DNA pull down實(shí)驗(yàn)外包_西安淳風(fēng)生物科技有限公司，經(jīng)PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子片段； ② 將其克隆至pMD-18T克隆載體，并測(cè)序鑒定成功； ③ 使用PCR法或末端標(biāo)記法標(biāo)記探針； ④ 標(biāo)記的探針利用凝膠回收試劑盒純化回收探針，并檢測(cè)探針濃度； ⑤ -20℃保存，待用； 2．Pull down ① 預(yù)先混合 5 μg 生物素標(biāo)記的 DNA 和 500 μg 核蛋白，置于冰上； ② 取 100μL 串珠，用冰冷 PBS 洗一次，5000 g 離心 30 秒； ③ 將 DNA 與蛋白的混合物加到串珠中，重懸珠子； ④ 4℃孵育 1 小時(shí)； ⑤ 5000g，離心 30 秒，去除上清，收集沉淀； ⑥ 用冰冷 PBS 洗串珠三次，5000 g 離心 1 分鐘，盡可能去除上清，收集沉淀； ⑦  加入 30 μL 蛋白上樣緩沖液，重懸沉淀，沸水煮 10 分鐘， 3．蛋白質(zhì)檢測(cè)-- Western Blot ① 電泳：實(shí)驗(yàn)采用不連續(xù)系統(tǒng)蛋白質(zhì)SDS-PAGE，濃度為5%濃縮膠和8~12%濃度分離膠；每孔上樣40~60 ug總蛋白，開(kāi)始電壓為100 v,到達(dá)分離膠后調(diào)為120 v；

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② 轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜為恒流轉(zhuǎn)膜，電流為200 mA，時(shí)間根據(jù)目的蛋白分子量選擇60~120 min。 ③ 封閉：蛋白膜放置到TBST溶液中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液；加入5%脫脂奶粉封閉液，室溫50rpm，封閉60分鐘。 ④ 孵育一抗：根據(jù)蛋白Marker指示將PVDF膜剪開(kāi)，參考一抗?jié)舛?；將PVDF膜分別放入含各自一抗溶液中，4度孵育一抗過(guò)夜，然后放入TBST洗滌液，搖動(dòng)洗滌3次，每次15 min。 ⑤ 孵育二抗：參考二抗?jié)舛?，按比例稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗。將PVDF膜加入稀釋好的二抗，室溫?fù)u動(dòng)孵育1h；放入TBST洗滌液，搖動(dòng)洗滌3次，每次15 min。 ⑥ 顯色：使用化學(xué)發(fā)光試劑，黑暗處顯色，用X光片壓片，顯影液及定影液洗片。 4．蛋白質(zhì)檢測(cè)-- MS ① 切膠：用刀片切取膠粒（膠粒直徑1-2 mm），置于1.5mL EP管中。 ② 清洗：用200 uL MilliQ震蕩清洗2次，蘭州DNA pull down公司_昆明DNA pull down公司_西安淳風(fēng)生物科技有限公司，每次10分鐘。 ③ 脫色：對(duì)于考染膠，加考染膠色液（25mM NH4HCO3， 50% ACN）200uL，37℃ 20分鐘或超聲脫色5分鐘，吸干，重復(fù)脫色2-3次，至藍(lán)色褪去。 ④ 脫水：加ACN 100 μL脫水至膠粒變白，吸棄ACN。 ⑤ 清洗：用200 μL MilliQ震蕩清洗2次，每次10分鐘；然后用200uL 50% ACN震蕩清洗2次，每次10分鐘。 ⑥ 脫水：加ACN 100 μL 脫水至膠粒變白，吸棄ACN。 ⑦ 用25 mM NH4HCO3稀釋Trypsin 至12.5 mg/ml，每管加10 μL，稍微離心一下，讓酶液與膠粒充分接觸，4℃放置30 min ，待酶液被膠粒完全吸收，吸棄多余的酶液，加25 mM NH4HCO3 20uL，37℃過(guò)夜(16h)。 ⑧ 質(zhì)譜樣品使用德國(guó)Bruker公司的Ultraflex III質(zhì)譜儀開(kāi)展分析，參數(shù)設(shè)置：反射模式； ⑨ 離子源加速電壓1為24kv； ⑩ 加速電壓2為22kv； 11 離子延遲提取0.000ns； 12 真空度1.4×10-7 Torr； 13 質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加200次； 14 使用標(biāo)準(zhǔn)Maker峰作為外標(biāo)校正質(zhì)譜峰，正離子譜測(cè)定，測(cè)定范圍控制在700-4000； 15 樣品的肽質(zhì)量指紋圖譜，胰酶自降解峰和污染物質(zhì)的峰自動(dòng)剔除； 16 利用LIFT軟件將PMF強(qiáng)度較大的5個(gè)峰進(jìn)行串級(jí)質(zhì)譜分析（峰強(qiáng)度大于300）。

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