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雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（luciferase Assay）目前由兩個(gè)主要的應(yīng)用方向，一是檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動(dòng)子區(qū)DNA相互作用，租西寧雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)服務(wù),西安醫(yī)藥、保養(yǎng)，轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白質(zhì)分子，也稱為反式作用因子。某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動(dòng)子中的特異順序結(jié)合，這些特異性的序列被稱為順式因子，轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和順式因子實(shí)現(xiàn)共價(jià)結(jié)合，從而對(duì)基因的表達(dá)起抑制或增強(qiáng)的作用。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（luciferase Assay）是檢測(cè)這類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動(dòng)子中的特異順序結(jié)合的重要手段，第二是研究微小RNA(microRNA)對(duì)于靶基因的調(diào)控，租西寧雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)服務(wù),貴陽(yáng)醫(yī)藥、保養(yǎng)，西安淳風(fēng)生物科技有限公司,西安淳風(fēng)生物科技有限公司,通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)microRNA潛在的靶基因以及干預(yù)位點(diǎn)序列，并設(shè)計(jì)合適的microRNA質(zhì)粒或干預(yù)片段，同時(shí)構(gòu)建靶基因的報(bào)告基因質(zhì)粒，二者同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，這是確定microRNA是否能影響（上調(diào)或下調(diào)）靶基因的首選研究方法。 實(shí)驗(yàn)原理： 1）構(gòu)建一個(gè)將靶啟動(dòng)子的特定片段插入到熒光素酶表達(dá)序列前方的報(bào)告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic（轉(zhuǎn)錄因子與靶基因）或pMIR-REPORT Luciferase質(zhì)粒（微小RNA與靶基因） 2） 將要檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒（或microRNA質(zhì)粒）與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞或目的細(xì)胞。如果此轉(zhuǎn)錄因子（或microRNA）能夠激活靶啟動(dòng)子，則熒光素酶基因就會(huì)表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比。 3） 加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光素，通過(guò)檢測(cè)熒光的強(qiáng)度可以測(cè)定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動(dòng)子片段有作用。 實(shí)驗(yàn)步驟（動(dòng)物）： （1） 用生物信息學(xué)方法分析并預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。 （2） 設(shè)計(jì)引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動(dòng)子片段，將此片段插入到熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒中。 （3） 篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序，擴(kuò)增克隆并提純質(zhì)粒備用。 （4） 擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒（或microRNA質(zhì)粒），提純備用，同時(shí)準(zhǔn)備相應(yīng)的空載質(zhì)粒對(duì)照。 （5） 培養(yǎng)293細(xì)胞（或其它目的細(xì)胞），并接種于6孔板中，生長(zhǎng)24小時(shí)（80%匯合度）。 （6） 將報(bào)告基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 （7） 用適當(dāng)?shù)姆椒ㄌ崛〉鞍撞⒂糜跓晒馑孛笝z測(cè)。 （8） 加入酶作用底物，于熒光計(jì)數(shù)儀上測(cè)定熒光素酶的活性。 （9） 計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度，并與空載對(duì)照比較，判斷影響因子是否有效的作用于靶基因。

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實(shí)驗(yàn)步驟（植物）： 1. 挑取單克隆于LB液體培養(yǎng)。 2. 將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中（加有與1相同的抗生素）。加入乙酰丁香酮和MES，28度搖床培養(yǎng)。 3.離心收集菌體。 4. MgCl2重懸菌體加入AS。 5. 取正處于生長(zhǎng)期的煙草葉片，使用針頭在葉片反面扎些小孔。 6. 將侵染液裝入5 ml 注射器內(nèi)，用拇指按壓注射器反板將液體從葉片下表皮注射到煙草葉片內(nèi)。注射后，煙草葉片會(huì)出現(xiàn)濕潤(rùn)的現(xiàn)象。 7. 注射后熒光素酶檢測(cè)試劑盒（Dual-Luciferase Assay System, Promega公司）（具體步驟詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)）在promega發(fā)光檢測(cè)儀（Promega Glomax 2020）分析熒光素酶活性。 8. 根據(jù)雙報(bào)告系統(tǒng)測(cè)得的熒光值，2019爆款西寧雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)服務(wù),西北醫(yī)藥、保養(yǎng)，算出目的基因質(zhì)粒的熒光值/內(nèi)參質(zhì)粒熒光值（即F/R值），并算出相對(duì)于對(duì)照組的比值，求出標(biāo)準(zhǔn)誤，作出直方圖。

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