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Invitrogen核/膜系統(tǒng) 一、 實驗原理： 真核生物基因的轉錄起始需轉錄因子參與，杭州酵母單雜交文庫構建,醫(yī)藥、保養(yǎng)，轉錄因子通常由DNA結合結構域(DNA—binding domain，BD)和轉錄激活結構域(activation domain，AD)。用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉錄因子，GAL4的DNA結合結構域靠近羧基端，含有幾個鋅指結構，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(UAS)，而轉錄激活結構域可與RNA聚合酶或轉錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，DNA結合結構域和轉錄激活結構域可完全獨立地發(fā)揮作用。在GAL4系統(tǒng)中構建與基因的ORFs融合的激活結構域GAL4-AD的特異載體，順式作用元件與GAL4的DNA結合結構域GAL4-BD融合構建載體，分別轉化酵母細胞。在酵母內表達的蛋白若與順式作用元件發(fā)生相互作用時，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結合在一起，從而與上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)結合，西安淳風生物科技有限公司,西安淳風生物科技有限公司,激活相應報告基因的表達，在相應的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽性。基因轉錄實際上是轉錄調控因子和啟動子區(qū)各種順式作用元件相互作用的結果，這種結合猶如蛋白質與蛋白質的互作一樣具有特異性，這是研究順式作用元件即DNA序列與蛋白質互作的基礎。 實驗步驟： 1.1 RNA提取 1.2 mRNA分離 1.3 cDNA初級文庫的構建 1.3.1 cDNA一鏈的合成 1.3.2 cDNA第二鏈的合成 1.3.3 cDNA adapter的制備 1.3.4 cDNA與attB1重組接頭連接(三份接頭各連一份) 1.3.5 cDNA分級分離 1.3.6 BP重組 1.3.7 電轉化大腸桿菌DH10B 1.3.8 文庫克隆檢測 1.3.9 文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定 1.4 cDNA次級文庫的構建 1.4.1 初級文庫的質粒抽提 1.4.2 LR重組 1.4.3 電轉化大腸桿菌DH10B 1.4.4 文庫克隆檢測 1.4.5 文庫庫容量、重組率、插入片段長度鑒定 三、實驗結果： 次級文庫庫容大于107，重組率大于90%，平均插入片段大于1kb。 酵母單雜交技術最早是1993年由Li等從酵母雙雜交技術發(fā)展而來，通過對報告基因的表型檢測，分析DNA與蛋白之間的相互作用，杭州酵母單雜交文庫構建,超低價醫(yī)藥、保養(yǎng)，以研究真核細胞內的基因表達調控。由于酵母單雜交方法檢測特定轉錄因子與順式作用元件專一性相互作用的敏感性和可靠性，現(xiàn)已被廣泛用于克隆細胞中含量微弱的、用生化手段難以純化的特定轉錄因子。 酵母單雜交(Yeast one-hybrid)是根據(jù)DNA結合蛋白(即轉錄因子)與DNA順式作用元件結合調控報道基因表達的原理，克隆與靶元件特異結合的轉錄因子基因(cDNA)的有效方法。其理論基礎是:許多真核生物的轉錄激活子由物理和功能上獨立的DNA結合區(qū)(DNA-binding domain BD)和轉錄激活區(qū)(Activation domain AD)組成，因此可構建各種基因與AD的融合表達載體，在酵母中表達為融合蛋白時，2019爆款杭州酵母單雜交文庫構建,貴陽醫(yī)藥、保養(yǎng)，根據(jù)報道基因的表達情況，便能篩選出與靶元件有特異結合區(qū)域的蛋白。理論上，在單雜交檢測中，任何靶元件都可被用于篩選一種與之有特異結合區(qū)域的蛋白。

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